Soutenance de thèse 20/03/2025

La métabolomique permet de sonder et caractériser à l’échelle moléculaire l’état d’un organisme, évaluer l’influence d’un stress, qu’il soit lié à la présence d’autres organismes ou son environnement. La spectrométrie de masse montre un intérêt certain dans ce domaine grâce à sa sensibilité et sa capacité à analyser un grand nombre de métabolites simultanément sur une gamme de masse adaptée. Elle est classiquement utilisée pour les profilages métaboliques, par analyse directe en utilisant l’ultra-haute résolution ou en couplage avec des techniques séparatives comme la chromatographie liquide (LC-MS). La spectrométrie de masse peut également être mise en œuvre en mode imagerie (MSI). Elle permet l’analyse spatiale des métabolites sur des tissus biologiques. Cela en fait une approche de choix lors de l’étude des métabolites dans des contextes d’interactions ou d’étude de phénomènes organo-dépendants.

Dans ces travaux, nous nous sommes intéressés à l’apport de ces approches métabolomiques en écologie chimique. En particulier, l’étude a porté sur certaines bactéries du sol et leurs interactions avec les plantes. Une souche de Streptomyces sioyaensis, qui présente un effet néfaste sur la croissance de pousse de peuplier allant jusqu’à causer la nécrose des racines de la plante, a ainsi été étudiée par une combinaison d’analyses métabolomiques. Ainsi, le profilage métabolique par spectrométrie de masse avec et sans couplage et les analyses spatiales par MSI ont été menées. L’objectif de cette approche combinée est d’étudier la diversité des métabolites produits par ces deux organismes afin de trouver le ou les métabolites responsables de cet effet observé lors de leur interaction. Pour cela, l’imagerie par ionisation MALDI et spectrométrie de masse à très haute résolution (HRMS) a permis de suivre la diffusion des métabolites dans le milieu de culture alors que les profilages classiques par LC-MS ont permis de détailler l’évolution du sécrétome bactérien lors de la croissance de la bactérie. Cette combinaison a mis en valeur des molécules candidates possiblement impliquées dans la nécrose du système racinaire tout en permettant leur suivi dans le milieu de culture.

La réalisation, sur un même milieu de culture gélosé, de cette approche métabolomique combinée a nécessité le développement d’une méthode de préparation d’échantillon originale. La mise en place d’une membrane entre le milieu de culture et les organismes en interaction a permis d’obtenir d’une part, un échantillon adapté à l’analyse par imagerie et d’autre part, d’isoler les organismes en vue d’analyses HRMS et LC-MS après leur extraction. La preuve de concept a ainsi été démontrée pour l’étude de bactéries du genre Streptomyces (Streptomyces ambofaciens), produisant des métabolites connus telles que la desferrioxamine E.

Metabolomics allows probing and characterisation at molecular scale of an organism state, as well as evaluating the impact of stress whether it is related to the presence of other organisms or its environment. Mass spectrometry (MS) shows a high suitability in this field due to its sensitivity and its ability to analyse a large number of metabolites simultaneously within a chosen range. It is typically used for metabolic profiling by either direct analysis using ultra-high resolution or in combination to separative techniques such as liquid chromatography (LC-MS). Mass spectrometry can also be implemented in imaging mode (MSI). Thus, it allows the spatial localisation of metabolites on biological tissues making it an ideal method for the studies of metabolites during interactions or organo-dependent phenomena investigations.

Within these works, we explored the contribution of these metabolomics approaches to chemical ecology. Specifically, we focused on certain soil bacteria and their interaction with plants. A strain of Streptomyces sioyaensis, which has a detrimental effect on the growth of poplar sprouts, even causing roots necrosis, was studied with the combination of metabolomics approaches. Therefore, mass spectrometry-based metabolic profiling with and without coupling to LC and spatial analysis by MSI were carried out. The objective of this combined approach was the investigation of the diversity of the metabolites produced by both organisms during their interaction. The goal was the identification of the metabolite(s) involved in the detrimental effect observed. For this purpose, MALDI imaging with high-resolution mass spectrometry (HRMS) was used to track the diffusion of metabolites in the culture medium. Moreover, conventional LC-MS profiling detailed the evolution of the bacterial secretome during the bacteria growth. This combination highlighted possible molecules as candidates involved in the root system necrosis and also enabled their monitoring in the culture medium.

The implementation of this combined metabolomics approach on the same agar culture medium required the development of an original membrane-based sample preparation method. The use of a membrane between the culture medium and the interacting organisms resulted in a flat sample particularly suitable for imaging analysis of the culture medium. Thus, it enabled the mapping of metabolites diffused into the culture medium. It also allowed the isolation and extraction of organisms for subsequent HRMS and LC-MS analysis. A simplified model has served as proof of concept in this study. This model consisted in a single bacterial species, Streptomyces ambofaciens, which produces known metabolites such as desferrioxamine E. It was possible to detect this metabolite in the culture medium through both imaging and extraction.